Sebagian besar wanita hamil mengalami kolonisasi Streptococcus haemolyticus grup B (SGB) di saluran urogenital yang mempengaruhi kesehatan ibu hamil dan bayi. Deteksi SGB intrapartum perlu pemeriksaan yang cepat dan sensitif. Pemeriksaan mikrobiologi untuk mendeteksi SGB menggunakan metode kultur dan real time polymerase chain reaction (RT-PCR) telah digunakan untuk mendukung diagnosis, namun penggunaannya untuk skrining pada ibu hamil belum pernah diuji keakuratannya di Indonesia. Penelitian ini bertujuan untuk mencari metode terbaik untuk mendeteksi kolonisasi SGB pada ibu hamil sekaligus menilai akurasi uji RT-PCR. Penelitian dengan metode potong lintang pada wanita hamil kurang dari 37 minggu dengan ketuban pecah di Rumah Sakit Umum Pusat Nasional Cipto Mangunkusumo (RSCM), Rumah Sakit Umum Daerah Pasar Rebo, dan Rumah Sakit Budi Kemuliaan, serta bayi baru lahir dengan tersangka sepsis neonatorum awitan dini yang lahir dari ibu tersebut di RSCM. Swab rektovaginal ibu dan darah bayi untuk pemeriksaan tes RT-PCR dan kultur pada 3 media: agar darah (AD), agar darah Columbia (ADC), dan CHROMagar (CA). Ada 50 ibu dan 25 bayi direkrut dalam penelitian ini. Prevalensi SGB pada ibu hamil 24%, 2 bayi meninggal. Dibandingkan dengan kultur dengan media ADC, tes RT- PCR mempunyai sensitivitas 83,33%, spesifisitas 86,84 %, NPP 66,67 %, NPN 94,29 %, dan akurasi 86,00 %. Media CA menunjukkan hasil yang lebih tinggi dalam hal sensitivitas 100%, spesifisitas 100%, NPP 100%, NPN 100%, dan akurasi 100 %, dengan hasil lebih singkat, praktis, dan murah. Pemeriksaan RT-PCR menjadi pilihan dalam skrining SGB intrapartum, dengan alternatif media CA.